Что сделал коронавирус для науки и медицины

Скачать и распечатать вирус

Геном нового коронавируса SARS-CoV-2 китайские учёные опубликовали практически сразу после появления информации о вспышке, в первых числах января 2020 года. Возможность изучать врага, пусть и не в лицо, получили все.

Любители конспирологических теорий немедленно начали искать следы искусственного конструирования генома. Шуму было много, однако никто из серьёзных учёных эти теории не поддержал. Не стоит множить сущности сверх необходимого: SARS-CoV-2, такой, какой он есть, вполне мог произойти от коронавирусов животных, скорее всего летучих мышей. Вероятно, через промежуточного хозяина: сначала подозревали панголинов, а сейчас ещё и пушных животных на зверофермах. Норки и енотовидные собаки оказались восприимчивы к вирусу — в Китае активно разводят и тех, и других.

Методы изучения геномов, опробованные на гриппе, отлично подошли для изучения коронавируса. Глобальная научная инициатива GISAID, которая со времён «свиной» пандемии обеспечивала открытый доступ к геномам вирусов гриппа, взялась за SARS-CoV-2. Секвенирование — чтение геномных последовательностей — стало достаточно дешёвым, чтобы мы могли получать геномы из всех стран мира. Зайдя на сайт nextstrain.org/ncov/global?l=radial, любой желающий может увидеть родословное древо супостата. Каждая точка — геном вируса от больного в Ухане, Москве, Нью-Йорке...

Вирусы с РНК-геномами очень изменчивы. Пока SARS-CoV-2 гуляет по планете, в его геноме накапливаются отличия. Учёные сравнивают геномы и делают выводы, откуда пришёл конкретный вирус, выделенный у больного в Москве, — из Китая или из Италии. Примерно так же специалисты по рукописным книгам сравнивают ошибки переписчиков и определяют, какой манускрипт был исходным, а какой копией. Так можно узнать много интересного о путях и скорости распространения инфекции.

На сайте nextstrain.org любой желающий может увидеть родословное древо супостата. Каждая точка — геном вируса от больного в Ухани, Москве, Нью-Йорке...

Части света, в которых были получены образцы коронавируса, на схеме обозначены разными цветами. Легко увидеть, что близкородственные образцы, сидящие на одной веточке, могли быть найдены в Азии, Европе, Америке. Издержки глобализации: множество людей летает за границу в командировки и считает год пропавшим, если не удаётся провести отпуск у тёплого моря. Геномы коронавируса от российских пациентов довольно разнообразны и близки к западноевропейским.

С геномом можно работать не только в компьютере. Получить реальный коронавирус из Китая в первые месяцы учёным других стран было сложно. Проще казалось синтезировать ген вируса — превратить последовательность букв-нуклеотидов в реальную молекулу ДНК. (Есть фирмы, которые принимают такие заказы; это недёшево, но крупному научному центру по карману.) Ну а с генов уже можно экспрессировать белки вируса и начинать их изучение. Например, S-белок — тот самый, что образует характерные шипы «короны» и обеспечивает проникновение коронавируса в клетку, — повсеместно исследовали уже в первые месяцы 2020 года.

В феврале Ральф Барик из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилле заявил, что собирается получить синтетическую версию SARS-CoV-2: синтезировать ДНК-копию генома, на её основе молекулу РНК — искусственный геном коронавируса, и ввести затем эту РНК в клетки, которые начнут производить вирус. Американцам коронавирус был нужен для исследовательских целей — никто и предположить не мог, что скоро в США его будет сколько угодно.

Звучит фантастически — взять из интернета файл с геномом, распечатать вирус. На самом деле это давно не фантастика. Ещё в 2002 году учёные синтезировали геном вируса полиомиелита и создали вирус, способный убивать мышей. В 2005-м был воссоздан пандемический вирус 1918 года — испанского гриппа.

Лаборатория Ральфа Барика в Северной Каролине специализируется на инженерных вирусах, не встречающихся в природе. В 2008 году у них вышла статья под названием «Синтетические рекомбинантные SARS-подобные коронавирусы летучих мышей, способные инфицировать культивируемые клетки и мышей». Они хотели узнать, как должен измениться вирус, чтобы перескочить на человека. Ведь если понимать это, мониторинг вирусов животных поможет вовремя обнаружить опасность. Вполне ожидаемо опасными сочли сами эти исследования, на некоторое время группу даже лишили финансирования. И можете представить, какой эффект произвела эта публикация сейчас, когда её откопали конспирологи. Но, конечно, фирмы, которые синтезируют гены и геномы, думают о безопасности. Кто попало не может заказать гены оспы или чумы.

CRISPR против COVID-19

Наверное, никогда ещё в мире не выполнялось столько ПЦР-тестов и тестов на антитела. Все, от пионеров до пенсионеров, за несколько месяцев начали разбираться в трудных вопросах молекулярной биологии, биохимии, иммунологии. ПЦР — полимеразная цепная реакция, если эта реакция пошла и в пробе увеличивается количество определённого фрагмента ДНК, значит, геном возбудителя найден, человек заражён. Садись, пять.

Анализ на антитела к вирусному белку в сыворотке крови говорит о том, что человек с этим вирусом уже встречался. Долго сохраняются в крови не любые антитела, а только иммуноглобулины G (IgG), так что, если мы хотим оценить долю переболевших в популяции, мерить надо именно их… Всё оказалось не так сложно, когда эти вопросы коснулись нас напрямую.

В ПЦР-тестах и тестах на антитела нет ничего необычного. (Кроме того, что все страны научились их делать в огромном количестве. И это хорошо: пандемия коронавируса пройдёт, а грипп, ВИЧ, гепатиты и множество других инфекций останутся, и с ними надо будет бороться.) Но теперь у нас есть принципиально новые тест-системы, появления которых при иных обстоятельствах мы ждали бы годами.

Например, «нобелевская» технология CRISPR-Cas. Все следят за её применением для редактирования геномов клеток, животных и даже людей (вы ещё не забыли о Хэ Цзянькуе и отредактированных близняшках?). Все устали следить за многолетней патентной баталией между Дженнифер Дудной, Эммануэль Шарпантье, Венским университетом и Университетом Калифорнии в Беркли с одной стороны и Фэном Чжаном и Институтом Брода — с другой. Пока что у другой стороны явный перевес: в США права на применение CRISPR-Cas для редактирования геномов млекопитающих, в том числе человека, достаются Чжану. Зато Нобелевская премия уходит к Дудне и Шарпантье.

Гораздо меньший интерес вызывает соревнование Дженнифер Дудны и Фэна Чжана в области диагностического применения CRISPR-Cas.

Cas — это нуклеаза, фермент, разрезающий ДНК. Направляет его в нужное место специально сконструированная гидовая РНК. Для редактирования геномов обычно применяется нуклеаза Cas9. Но есть и другие Cas-нуклеазы. Некоторые из них имеют вредную привычку после разрезания мишени резать ещё какую-нибудь молекулу поблизости. Для редактирования генома это плохо, зато для диагностики просто отлично! Можно добавить в образец репортерную молекулу ДНК, к одному концу которой пришита молекула, способная флуоресцировать, а к другому — гаситель флуоресценции. Если CRISPR-Cas найдёт в этом образце свою мишень (например, ген вируса), она «под горячую руку» разрежет и молекулу-репортер. Флуоресцентная группа отдалится от гасителя — в образце можно будет детектировать свечение.

Поскольку флуоресцентное вещество обычно окрашено в яркий цвет, ту же молекулу можно детектировать иным способом — с помощью хроматографии, проще говоря, тест-полоски вроде теста на беременность. Половинка молекулы с окрашенной группой пробежит дальше, чем пробежала бы целая, и образует вторую окрашенную линию, которая и скажет пациенту: «Вы инфицированы SARS-CoV-2!»

Тесты, основанные на этом принципе, пионеры CRISPR-Cas и их коллеги придумывают давно. Дженнифер Дудна стала соучредителем компании Mammoth Biosciences, Фэн Чжан — компании Sherlock Biosciences. Обе предлагают очень похожие технологии тестирования. И в мае 2020 года набор Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 был разрешён в США к применению в экстренной ситуации. Началась эра CRISPR Dx — диагностических приложений «генетических ножниц». Тест DETECTR CRISPR-Cas12 от Mammoth Biosciences получил разрешение в сентябре.

Красоту идеи портит стадия амплификации. Чтобы получить заметные количества материала для анализа, приходится многократно умножать участок-мишень. При этом используется изотермическая амплификация: похоже на ПЦР, но удобнее для экспресс-методов, поскольку не требует температурного цикла — нагревания и охлаждения пробирки. Было бы эффектнее обходиться без амплификации, и команда Дженнифер Дудны уже опубликовала препринт, в котором описывается такой метод. CRISPR-Cas-реакция проводится в маленькой коробочке со встроенным лазером для возбуждения флуоресценции, детектировать свечение предлагается с помощью камеры смартфона.

Не отстаёт и другой модный метод — нанопоровое секвенирование от британской компании Oxford Nanopore Technology. Её приборы «читают» единичные молекулы нуклеиновых кислот. Нанопора — это крошечное отверстие в полимерной мембране. Сквозь нанопору проходит ионный ток, и когда проползает молекула ДНК или РНК, отдельные буквы-нуклеотиды перекрывают отверстие, каждая из четырёх — по-своему. Информация об изменении тока позволяет расшифровать нуклеотидную последовательность.

Теперь на приборах Oxford Nanopore, от секвенатора-флешки MinION размером с ладонь до больших GridION и PromethION, можно делать тесты для выявления нового коронавируса. Тест-система называется LamPORE. Она тоже использует изотермическую амплификацию образцов, в каждом из которых копируются определённые участки вирусного генома — если вирус там есть. При этом к молекулам прикрепляется нуклеотидная последовательность, своего рода штрихкод, уникальный для каждого образца. Затем образцы смешивают и запускают секвенирование — читать всё подряд, прибор разбёрется, чей штрихкод связан с вирусными генами и кто, соответственно, заражён.

Для анализа нужен мазок из носоглотки или ротоглотки, как и для ПЦР-тестов. Миниатюрный MinION может проанализировать до 96 образцов за час, 1152 образца — за четыре с половиной часа. Настольный GridION — в пять раз больше.

Компания предложила свой тест для скрининга групп риска — чтобы хоть каждую неделю проверять учителей, продавцов, полицейских. Поскольку секвенаторы портативные, исключается этап транспортировки в лабораторию. А это сокращает время до получения результата, то есть ковид-положительный после анализа не гуляет по городу три дня, прежде чем узнает свой статус. LamPORE уже разрешён к применению не только в Великобритании, но и в Евросоюзе, на очереди США и Арабские Эмираты.

Увидели бы мы в 2020 году массовое применение теста на основе нанопорового секвенирования, если бы не коронавирус? Вряд ли.

Есть множество других удивительных тестов. Например, продукт компании Abbott, который Дональд Трамп взял с собой на встречу с избирателями в сентябре (и это был один из немногих выигрышных для него моментов на этой встрече). Тест BinaxNow COVID-19 Ag Card определяет белок коронавируса в мазке из носа за 15 минут. Выглядит он как маленькая карточка, стоит около пяти долларов. Результат появляется в мобильном приложении смартфона — зашёл в общественное место и тут же предъявил всем любопытствующим.

Вакцины XXI века: инструкция по синтезу антигена

Десять вакцин против коронавируса уже достигли третьей фазы клинических исследований, то есть испытываются на десятках тысяч людей. Проверяется не только безопасность, но и главное — насколько эффективно вакцина предотвращает заражение. Среди них есть инактивированные — это классика жанра, они содержат нежизнеспособные коронавирусы, на которых иммунная система обучается бить врага. Есть субъединичная вакцина компании Novavax (кстати, отличная по иммуногенности и безопасности), она содержит S-белок коронавируса. Субъединичные вакцины тоже не новость. Другое дело — аденовирусные вакцины и вакцины на основе мРНК.

Как работает вирусный вектор? Ген белка коронавируса, который будет антигеном, — как правило, всё тот же S-белок или его часть, — встраивается в геном безвредного вируса, который проникает в клетку и запускает в ней синтез коронавирусного белка.

Иногда используются реплицирующиеся векторы, которые размножаются в организме и за счёт этого вызывают более сильный иммунный ответ. Но аденовирусные вакцины — финалисты гонки все нереплицирующиеся. Это вакцина, которую разработали в Оксфордском университете, а развивает компания AstraZeneca (аденовирус шимпанзе), вакцины китайской компании CanSino (аденовирус 5) и Janssen, дочерней компании Johnson&Johnson (аденовирус 26), а также наша вакцина НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи — Гам-КОВИД-Вак, она же «Спутник V» (аденовирусы 26 и 5).

Аденовирусные платформы для вакцин их разработчики часто именуют «проверенными». Действительно, по сравнению с вакцинами на основе мРНК аденовирусные более проверенные. Однако на сегодня эта технология используется только в одной коммерческой вакцине — вакцине против бешенства для иммунизации диких животных.

Аденовирусным векторам не особенно везло. Например, Джесси Гелсингеру, первому человеку, умершему от генной терапии в 1999 году, необходимый для лечения ген без мутации ввели как раз в аденовирусном векторе, и у него развилась мощная иммунная реакция. Но это было давно, и вектор участникам испытаний вводили в чудовищных дозах — на много порядков больше тех, что используются при вакцинации.

Если речь идёт о разработке вакцины от инфекционного заболевания, незначительное воспаление, вызванное небольшой дозой, — это плюс. Аденовирусные вакцины должны лучше стимулировать Т-клеточный иммунный ответ, который необходим, чтобы избавить организм от вируса, уже проникшего в клетки. С начала 2000-х разрабатывают аденовирусные вакцины именно против патогенов, которые скрываются в клетках, таких как ВИЧ, малярия и туберкулёз. То, что ни одна ещё не вышла на рынок, нормально: в мирное время вакцины создаются и испытываются десятилетиями. Вакцина против ВИЧ оказалась неэффективной, были даже данные, что аденовирусный вектор увеличивает чувствительность к инфекции. Обнадёживающие результаты показали вакцины против лихорадки Эбола — и наша, и компании CanSino.

С аденовирусами 5 и 26 есть проблема: многие люди имеют иммунитет к «диким» аденовирусам, их иммунная система сразу атакует вектор и не даёт организму выработать иммунитет к SARS-CoV-2. Именно поэтому институт Гамалеи взял два разных вектора для первой и второй инъекции. А исследователи из Оксфордского университета в 2012 году разработали собственный вектор на основе аденовируса шимпанзе — ChAdOx1.

Вакцины на основе мРНК — нечто фантастическое, тем не менее их уже получили десятки тысяч людей во всём мире. В организм доставляется только матричная РНК вирусного белка — голая инструкция по его синтезу. РНК в липидных частицах вводится внутримышечно, как обычные вакцины, проникает в клетки и экспрессирует белок вируса. Прекрасны РНК-вакцины прежде всего тем, что их можно производить полностью in vitro, для этого не нужны даже культуры клеток! Но поставлять их, увы, необходимо в замороженном виде, лиофилизировать (превращать в сухой порошок), как белковые и вирусные вакцины, нельзя. Это затрудняет хранение и транспортировку.

Таких вакцин среди финалистов пока две. Одну разрабатывает компания Moderna совместно с Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний США. Другую — компании BioNTech и Pfizer при участии китайской Fosun Pharma. Moderna сразу вырвалась в лидеры, начав клинические исследования ещё в марте. Это стало возможно благодаря наличию вакцины против MERS, нацеленной на S-белок этого вируса. Маленькая замена — и вот вам вакцина против нового коронавируса!

Сейчас много говорят о том, что нужно создавать больше прототипов вакцин, желательно уже испытанных на животных и маленьких группах людей, которые можно будет легко превратить в вакцину против нового патогена. COVID-19 вряд ли будет последней пандемией в истории, и надо выучить этот урок.

В целом можно сказать, что наука достойно приняла вызов. Человечество постковидной эпохи будет усталым и гораздо более бедным, чем год назад. Но и более умным, хотелось бы верить.

Опубликовано в журнале «Кот Шрёдингера» №2 (43) за ноябрь 2020 г.